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Ein Teil dieser Arbeit wurde am 2. Ein erfahrener microscopist ist mindestens 14 Zellklassen in Knochenmark oder Blut zu klassifizieren. Unser Ziel war es, die sieben Parameter in unserem Flow zu verwenden cytometer eine zuverlässige Differentialzählung mit nur einem Rohr zur Verfügung zu stellen, Auswählen von Varizen Zubereitung. Periphere Blutproben wurden auf dem Beckman Coulter LH Zellzähler analysiert und die Beflaggung und Nachrichten aus dem Zellzähler verwendet wurden normalen oder pathologischen Proben auszuwählen.

Validierung gegen digitalisierte Mikroskopie und Zellzähler zeigte lineare Korrelationen in jeder Zelle Klasse mit Korrelationskoeffizienten, die für die zelluläre Klassifizierung vernünftig erscheinen. Die niedrigste Korrelation wurde für basophilen Granulozyten. Durchflusszytometrie nachgewiesen doppelt so viele unreife Neutrophile im Vergleich zu Mikroskopie.

Blut und Knochenmark Differentiale sind wichtig für die Diagnose als auch für die Bewertung der Therapie. Viele Labors erhalten eine zunehmende Anzahl von Knochenmarkproben mit vage definierten diagnostischen Fragen gerichtet auf den Ausschluss bösartiger Erkrankung oder peripherer Zytopenie zu untersuchen.

Mikroskopische Klassifizierung von Leukozyten in pathologischen Zuständen kann schwierig und zeitraubend sein, besonders dann, wenn die pathologischen Zellen einen geringeren Anteil bilden. Traditionell wird ein Leukozyten Differentialzählung durch mikroskopische Klassifizierung eines gefärbten Abstrich der Probe erreicht, und ein erfahrener microscopist ist mindestens 14 unterschiedliche Zellklassen in Knochenmark oder Blut 1 zu klassifizieren. Über sieben Zellklassen sind in der Granulozyten Fach, verschiedene Arten von myeloischen Reifung und Differenzierung zu beschreiben.

Die subjektive Beurteilung ist beträchtlich, und unreife Zellen von verschiedenen Linien können sehr ähnlich sein. Die Bildanalyse kann jedoch durch Computersoftware durchgeführt werden, um menschliche Subjektivität in beiden Zellprobennahme und Klassifizierung zu reduzieren. Automatisierte Zellzähler haben den Arbeitsablauf des hämatologischen Labor revolutioniert und sind nur für Blut verwendet und nicht für Knochenmark.

Einige der Fehler in Strömungsbasierten Zellenzähler sind abhängig von der Vorbehandlung der Zellen, bevor sie die Strömungskammer ein. Die Vorbehandlung zielt darauf ab, die roten Blutkörperchen zu entfernen und die Leukozyten zu modifizieren, so dass unterschiedliche Zellklassen mehr oder weniger intakt.

Diese modifizierten Zellen werden dann in dem Differentialzählung Kanal des Instruments analysiert. Die lysierende Empfindlichkeit für eine bestimmte Zellpopulation kann variieren und wird analytischen Fehler in Zellzähler verursachen sowie in Durchflusszytometer 3.

Selbst in den Zählern heute Zelle, zu wenige Parameter werden auf jeder Zelle analysiert, um umfassende Charakterisierung von Leukozyten zu ermöglichen, insbesondere bei pathologischen Zuständen. Durchflusszytometrie Multi die Verwendung mehrerer Antikörper zusätzlich zu Lichtstreuung zu ermöglichen, und am Durchflusszytometer mindestens sieben Messungen an jeder Zelle zur Verfügung stellt, durch den Laserstrahl verläuft.

Durchflusszytometrie Immunophänotypisierung wird von vielen hämatologischen Labors zur Erkennung und malignen Zellen in Lymphom oder Leukämie zu charakterisieren, Auswählen von Varizen Zubereitung. Im Gegensatz dazu wird Durchflusszytometrie selten verwendet, um normale Zellen in Der Grad von Krampfadern in den Beinen und Knochenmark zu klassifizieren.

Durchflusszytometrie kann leicht alle unterschiedliche Zellklassen und Reifestadien identifizieren durch umfangreiche Antikörper-Panels in mehreren Teströhrchen verwenden.

Wie bei den Zellzähler, Auswählen von Varizen Zubereitung, sind die Fehler in der Durchflusszytometrie wahrscheinlich abhängig von der Vorbehandlung der Zellen, bevor sie die Strömungskammer ein. Zusätzlich zu Antikörper-Inkubation und Lyse der roten Blutzellen können die Zellen mehrmals vor der Analyse gewaschen werden, um überschüssige Antikörper und roten Zelltrümmer zu entfernen.

Die umfangreiche Vorbereitung vor der Analyse ist wahrscheinlich Zellverluste zu verursachen, insbesondere der fragilen Zellen. Somit sind die analytischen Fehler unterscheiden sich in mikroskopisch kleinen, Zellzähler und Durchflusszytometrie-Methoden. Der Übergang zu neuen Methoden wird durch das Fehlen von Referenzverfahren für die Validierung der zellulären Klassifizierung ernsthaft behindert.

Die mikroskopische Leukozyten-Differential ist ungeeignet als Referenzmethode sowohl wegen der Ungenauigkeit und der Mangel an Qualitätsparameter, wie oben erörtert. Kein Zellzähler ist noch in der Lage, die unterschiedlichen Leistung der 14 Zellklassen in der Mikroskopie identifiziert zu nähern. Relativ haben nur wenige der Durchflusszytometrie basierende Leukozyten Differential Methoden veröffentlicht worden 4—9.

Nur eine dieser Methoden hatte den Ehrgeiz, alle Zellen in einer pathologischen Blutprobe oder normalem Knochenmark zu klassifizieren 5, 6. In der klinischen Laborpraxis werden die Zellzähler verwendet pathologische Proben zu identifizieren, die manuelle Überprüfung durch Mikroskopie dann bezeichnet werden.

Wir beschlossen, die Zellzähler zu verwenden, das Markieren der meisten pathologischen Proben auszuwählen, die dann mittels Durchflusszytometrie und Mikroskopie analysiert. Darüber hinaus normalen Proben, die den Zellenzähler Differential ohne Beflaggung geben wurden für Kreuzvalidierung von Zellzähler, Mikroskopie, eingesetzt und Durchflusszytometrie. Wir haben ein ein Rohr Immunophänotypisierung Panel für Leukozyten und Thrombozyten-Klassifikation entwickelt und validiert sie gegen digitalisierte Mikroskopie und einem automatisierten Zellzähler, in normalen und pathologischen Proben.

Die einfache und robuste Gating-Strategie ermöglicht es uns, alle verschiedenen Proben mit nur minimaler Einstellung für inidividual Unterschiede in fluorecense Intensitäten zu verarbeiten. Die Beckman Coulter 5C Zellkontrolle wurde zweimal täglich analysiert. In den beiden pathologischen Gruppen, die meisten der Proben wurden durch das LH mit mehreren flags angegeben. Die getrockneten Abstriche wurden fixiert und mit Mai Grunewald-Giemsa 1.

DiffMaster lokalisiert automatisch Zellen auf einem Blut-Abstrich. Eine geeignete Scanbereich auf dem Abstrich wird von Diffmaster basierend auf Erythrozytendichte gewählt.

Somit eliminiert die Diffmaster Instrument Abtastfehler, die eine der Hauptfehler in mikroskopischer Zellklassifizierung ist, Auswählen von Varizen Zubereitung. Bilder von Blutzellen lokalisiert und durch fortschrittliche Bildverarbeitung abgetastet. Die Software nutzt neuronale Netzwerk-Technologie, die die gesammelten Zellen in verschiedene Kisten sortiert.

Die Ergebnisse werden auf einem Computerbildschirm dargestellt, und alle Zellen der gleichen Klasse können zur gleichen Zeit untersucht werden. Verschiedene Klassen können gleichzeitig zum Vergleich, oder eine Einzelzelle näher untersucht werden angezeigt. Ein kompetenter Betreiber ist verpflichtet, Auswählen von Varizen Zubereitung vorgeschlagene Einstufung jeder Zelle zu bestätigen oder zu ändern.

Auch gibt es in der Regel mehrere Zellen, Auswählen von Varizen Zubereitung, die Diffmaster nicht Auswählen von Varizen Zubereitung der Lage ist, zu klassifizieren, z. Die Anregung erfolgte entweder durch eine einzige nm-Argonlaser oder sowohl von der nm-Laser und einem kollinearen nm roten Diodenlaser, und die Emission wurde in fünf Kanäle detektiert. Die Spannungseinstellungen aktualisiert wurden täglich Auswählen von Varizen Zubereitung die Zielkanäle in Tabelle 1.

Kompensationseinstellungen Tabelle 2 wurden durch die Analyse von Einzel farb- markierten Zellen mit Hilfe der Filteraufbau angegeben erhalten. Die Proben wurden Zytometrie aus Blutentnahme innerhalb von 24 h für die Strömung verarbeitet. Eine mu; 15 min bei Raumtemperatur l Antikörper-Cocktail; l Probe wurde mit 27,5-mu inkubiert. Der Cocktail wurde aus den folgenden Antikörpern hergestellt: DNA wurde durch Zugabe von 20 gebeizt mu; l einer Verdünnung von 1: Auch ohne Lyse der Erythrozyten, Färbung ist weniger gut, und es ist oft eine bimodale Verteilung.

Beachten Sie die verschiedenen Skalen auf der y -Achse. Ein myelodysplastischen Knochenmark mit lyse-resistente roten Zellen wurde Zytometrie für Fluss hergestellt, wie es in Material und Methoden beschrieben und dann ohne erworben e und f oder mit einem Live-Gate-Satz auf DRAQ5-positive Ereignisse g und h. Die Quantifizierung von nuklearen Ereignissen und Blutplättchen mittels Durchflusszytometrie und Zellzähler.

Der Erwerb Tor wurde auf Draq-positive Ereignisse eingestellt. Die absolute Zahl mit Flowcount Perlen Durchflusszytometrie mit Bezug auf die Impedanz messenen Blutplättchen durch den Zellenzähler kann als Indikator für die Thrombozytenverluste während der Herstellung verwendet werden.

Es war notwendig, Plättchen bei niedrigen Durchflussrate zu erhalten, da die Anzahl der Blutplättchen mit zunehmender Strömungsrate verringert, wahrscheinlich wegen der Koinzidenz Phänomene Auch wisch Zellen durch unspezifische Antikörper definierte Bindung siehe Fig. Somit wird oft der Strahlbereich nicht vollständig von benachbarten Zellen aufgelöst, d. Basophile, Erythroblasten oder degranulierten Granulozyten Fig.

Auch reife Neutrophile sind nicht gut aus unreifen Granulozyten und von eosinophilen Granulozyten aufgelöst. Sequential-Gating der nuklearen Ereignisse.

O—q Zellzyklusanalyse in Antikörper-gated Populationen. Erythroblasten von Platte über i o. Unreife Granulozyten aus Tafel e oben p. Im Knochenmark, sind Myelomzellen häufig CDpositiv. Kein tertiärer Gate von Plasmazellen ist, verwendet, aber die Plasmazellen werden aus dem Erythro 2-Gatters Tabelle 3 ausgeschlossen, Auswählen von Varizen Zubereitung. Diese Grundstücke werden auch verwendet, um die Regionen zu verschmieren Zellen zu Bein Varizen, wie helfen, die Antikörper gleich unspezifisch Abb.

Plasmazellen sind oft CD45 niedrig und kann die Erythroblast Region verseuchen, Auswählen von Varizen Zubereitung. Es ist wichtig, dass Erythroblasten auch in diesem Grundstück vorhanden sind, da muss der Explosion 1-Region in Richtung beider Erythroblast und basophilen Populationen angepasst werden. Die Durchflusszytometrie-Differential wurde validiert gegen den Zellenzähler und Auswählen von Varizen Zubereitung Differentiale. Die Korrelationskoeffizienten r -Werte sind in Tabelle 4 Korrelation Zahlen für neutrophile oder eosinophile Granulozyten und Lymphozyten Auswählen von Varizen Zubereitung sind ausgezeichnet, während die Korrelationen weniger gut für Monozyten und basophilen Granulozyten sind.

Die Korrelation mit normalen Proben: Unterschiedlichen Zellklassen, wie in der Figur angegeben, Auswählen von Varizen Zubereitung. Ähnliche Werte für alle Zellklassen wurden mit Ausnahme von Basophilen erhalten, in dem die Mikroskopie mehr Basophile im Vergleich zu Durchflusszytometrie nachgewiesen. In der Mikroskopie, gibt es jedoch eine besonders geringe Korrelation für Monozyten und Eosinophilen und basophilen Granulozyten gegen Strömung.

Es wird erwartet, als nur —Zellen wurden durch Mikroskopie gesammelt, im Vergleich Auswählen von Varizen Zubereitung von Zellzähler und Dementsprechend ist die Auswählen von Varizen Zubereitung Ungenauigkeit höher in mikroskopischer Klassifizierung, weil jede Zelle Klasse eher wenige Zellen enthalten Auswählen von Varizen Zubereitung. Mikroskopie wenn es Schmerzen, die mit Krampfadern die doppelte Anzahl von basophilen Granulozyten im Vergleich zu Zellzähler und die Korrelation niedrig war Tabelle 4.

Mikroskopische Klassifizierung erlaubt Vergleich auch in Bezug auf unreife Zellen, die normalerweise nur in Knochenmark. Ausgezeichnete Korrelation wurde für Erythroblasten erhalten.

Selbst Blastenzellen gut korreliert sind, die Verwendung von negativen Identifizierung von Blasten durch Durchflusszytometrie unterstützen. Korrelation zwischen Mikroskopie und Durchflusszytometrie mit Pathologische Proben.

Mit Flow, alle CDnegativen Granulozyten wurden als unreif eingestuft. Es gab jedoch eine ausgezeichnete Korrelation in der gesamten Granulozyten-Klasse, aber weniger gute Korrelation für die Neutrophilen Fig. Die Diskrepanzen Neutrophilen Einstufung hinsichtlich könnten dann die Fälle erläutert, bei dem Strom, der eine deutlich höhere Anzahl von Zellen als unreife als die durch Mikroskopie eingestuft eingestuft, Auswählen von Varizen Zubereitung.

Die Summe von unreifen und reifen Neutrophilen durch Fluss korreliert gut mit der Summe von unreifen und reifen Neutrophilen durch Mikroskopie Abb. Dennoch waren zweimal unreifen Granulozyten wie viele durch die Strömung im Vergleich zur Mikroskopie. Eine Probe von einem Patienten mit unreifen Zellpopulationen im peripheren Blut wurde ungenauen zellulären Klassifikation durch Auswählen von Varizen Zubereitung zum Vergleich ausgewählt, Mikroskopie und Durchflusszytometrie.

Die Zahl der insgesamt kernhaltigen Zellen unterschieden sich zwischen Zellzähler und Durchflusszytometer Tabelle 6.


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